Chemical Science：清华大学发文，揭示 spCas9 蛋白搜索靶点的分子机制模型

CIRSPR/Cas9 是一种在单条 guide RNA（gRNA）的指导下利用 Cas9 核酸酶对靶标 DNA 进行特异性识别和切割的技术。该过程涉及到 Cas9/gRNA 与双链 DNA（dsDNA）非特异性的结合、在 dsDNA 上搜索并识别 PAM 位点、通过与 PAM 上游的同源匹配形成 RNA/DNA 异源双链从而实现在 dsDNA 上靶点区域的特异性结合和切割。由于 Cas9 可以高效快捷地靶向并切割 dsDNA，因而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是，Cas9 如何在大量 DNA 中快速定位其靶标尚不清楚。尽管有研究报道了 Cas9 在低盐浓度下利用三维和一维扩散模式搜索靶点，但缺乏阐释其在生理盐浓度下靶标搜寻这一动态过程的结构生物学基础和分子定量模型。  

2021 年 8 月 20 日，清华大学生命科学学院陈春来和刘俊杰课题组合作在《化学科学》（Chemical Science）杂志发表了题目为 “spCas9 与 PAM 下游 DNA 位点的非特异性相互作用加速其靶点搜索过程（Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search）” 的研究论文。该论文揭示了在生理盐浓度下，spCas9 利用三维和一维扩散实现高效搜索靶点，其 1151-1156 位的赖氨酸残基与 PAM 下游 ~ 8 bp DNA 位点的非特异性结合是介导一维扩散并造成 PAM 侧翼不对称一维搜索的主要原因。该文揭示了 spCas9 在生理盐浓度下的独特搜索靶点机制和相应的结构生物学基础，为 Cas9 体内和体外的应用提供了重要指导。  

结合生化实验与单分子荧光技术，该研究发现，在生理盐浓度下，spCas9 利用三维和一维扩散实现快速搜寻靶点。spCas9 的一维扩散以 PAM 位点为中心展现出了不对称的搜索区域（从 PAM 上游 ~ 10 bp 到 PAM 下游 ~ 30 bp），将靶标搜索效率提高了 10 倍以上。同时，结合 Cas9/gRNA/DNA 二聚体的单颗粒冷冻电镜结构和单分子荧光实验进一步揭示，PAM 下游的~ 8 bp DNA 位点与 Cas9 的 1151-1156 位赖氨酸残基（尤其是 1153 位赖氨酸）之间的存在紧密的非特异性相互作用，是介导 Cas9 一维扩散并导致 PAM 侧翼的不对称搜索区域的主要原因。而通过改变 Cas9 与 DNA 的相互作用，包括突变 1151-1156 位赖氨酸残基、降低缓冲体系的盐浓度以及改变 PAM 识别残基，都会影响其一维扩散的过程。  

最后，该研究提出了 spCas9 搜索靶点的详细分子模型（图 1）：在生理盐浓度下，溶液中自由扩散的 Cas9/gRNA 复合物通过三维随机碰撞与 dsDNA 相互作用。一旦通过 1151-1156 位赖氨酸残基与 dsDNA 非特异性相互作用，spCas9 就会瞬时结合并沿 dsDNA 双螺旋进行~ 20 bp 的一维扩散以寻找 PAM 位点。一旦搜索到同源靶标就会结合形成复合物，否则会被释放进入溶液并重新进入搜索过程。spCas9 通过与 PAM 下游区域的非特异性结合使靶标搜索速率提高了 10 倍以上，该研究为 spCas9 的靶标位点设计提供了重要指导。  

清华大学生命科学学院陈春来研究员与刘俊杰研究员为本文共同通讯作者。清华大学生命科学学院 CLS 项目已毕业博士生杨梦铱（现为首都医科大学附属北京儿童医院营养与发育研究室研究实习员）为本文第一作者。生命学院 17 级博士生孙瑞瑞、结构生物学高精尖创新中心卓越学者邓谱涓, 医学院 CLS 项目 17 级博士生杨宇卓、王文娟高级工程师参与了本项目研究。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、北京市生物结构前沿研究中心、清华 - 北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。

原文链接：http://www.bio360.net/article/160121

Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search.pdf